引言

多肽是由氨基酸縮合連接而成的，具有一定生物活性的化合物分子。相對于蛋白質(zhì)物質(zhì)，空間結(jié)構(gòu)較為簡單、穩(wěn)定性較高，且具有較低的免疫原性。可作用于皮膚系統(tǒng)、肌肉骨骼系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等。隨著生物技術(shù)、合成技術(shù)及分析技術(shù)的快速發(fā)展，多肽已成為一個(gè)重要的生命科學(xué)研究領(lǐng)域。如今多肽產(chǎn)品已在醫(yī)療、保健食品、化妝品、新材料等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域，多肽藥物正發(fā)揮越來越重要的作用。

合成多肽引發(fā)的功效工業(yè)革命

從發(fā)現(xiàn)至今，合成多肽的發(fā)展也帶動了整個(gè)多肽產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，可以說在近30年，也是功效工業(yè)革命的引領(lǐng)者。

合成多肽來源主要有化學(xué)合成和生物合成兩種途徑，相比較于生物合成存在高效表達(dá)等技術(shù)難題且成本昂貴，難以用于規(guī)模生產(chǎn)，化學(xué)合成的多肽擁有無與倫比的優(yōu)勢，包括生產(chǎn)成本可控，氨基酸長度可控，尤其對與小分子寡肽類優(yōu)勢更加明顯，雜質(zhì)成分可控，可制定相對準(zhǔn)確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，易于工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)最大特色對于一些非天然存在的多肽種類（如乙酰基六肽-8不是天然存在的多肽）可以規(guī)?；煽厣a(chǎn)?；瘜W(xué)合成多肽已經(jīng)成為目前多肽的一種主流合成方法，尤其在藥品領(lǐng)域，基本都是化學(xué)合成多肽，酶解與基因工制成的多肽非常少見。

化學(xué)合成多肽的研究包含固相合成樹脂，多肽縮合試劑，氨基酸保護(hù)基的研究，并在此基礎(chǔ)上推動可持續(xù)性，綠色化學(xué)方面的多肽合成研究。90年代，合成多肽的研究及應(yīng)用進(jìn)入空前繁榮局面。

綠色化學(xué)合成多肽是未來趨勢

隨著多肽藥物研究和發(fā)展，人們對多肽的需求不斷上升，多肽行業(yè)規(guī)模在快速增長，同時(shí)也對多肽制藥工藝提出了更高的安全、環(huán)保要求。在現(xiàn)階段，單批次千克級的合成開始變得普遍，合成和純化過程中使用大量有機(jī)溶劑，對環(huán)保和可持續(xù)性因素產(chǎn)生了重大影響。其中一些包括：原子經(jīng)濟(jì)性極差導(dǎo)致產(chǎn)生大量危險(xiǎn)的化學(xué)廢物、多肽生產(chǎn)成本高昂等問題。因此，綠色可持續(xù)性的多肽合成已成為關(guān)注熱點(diǎn)。2019年，美國化學(xué)會（ACS）-圓桌會議小組對此發(fā)表了一篇關(guān)于多肽綠色可持續(xù)合成的綜述。文章中重點(diǎn)關(guān)注可持續(xù)性的綠色多肽合成技術(shù)，包括合成及純化方法，從研發(fā)到生產(chǎn)的綠色合成探索，并分析了當(dāng)前多肽合成和純化在可持續(xù)性方面面臨的挑戰(zhàn)。目前，這些技術(shù)雖然可能還未能大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于多肽生產(chǎn)，但我們相信，綠色合成多肽必然會帶來一番全新的局面，給多肽行業(yè)從業(yè)者指引新的方向，促進(jìn)行業(yè)快速健康發(fā)展。

為了幫助大家更好地了解綠色可持續(xù)性合成多肽，我們對全文進(jìn)行了翻譯，供大家參考，希望對大家在多肽制備工藝上有新的指引。

全文翻譯如下：

（由于小編能力有限，部分翻譯內(nèi)容可能存在誤區(qū)，請大家見諒）

近年來，制藥行業(yè)對治療性多肽的興趣與日俱增，市場上有超過 50 種多肽藥物，約 170 種處于臨床試驗(yàn)階段，超過 200 種處于臨床前開發(fā)階段。然而，目前肽合成技術(shù)主要涉及使用大量高危試劑和溶劑的傳統(tǒng)技術(shù)，很少關(guān)注綠色化學(xué)和工程。2016 年，ACS 綠色化學(xué)研究所制藥圓桌會議將肽 API 的綠色工藝開發(fā)確定為一個(gè)關(guān)鍵的未滿足需求，因此，成立了一個(gè)新的圓桌會議團(tuán)隊(duì)來解決這一重要領(lǐng)域。這個(gè)新團(tuán)隊(duì)的最初重點(diǎn)是突出肽合成的最佳實(shí)踐并鼓勵(lì)急需的創(chuàng)新。在這個(gè)觀點(diǎn)中，我們旨在總結(jié)當(dāng)前多肽合成和純化在可持續(xù)性方面面臨的挑戰(zhàn)，強(qiáng)調(diào)可能的解決方案，并鼓勵(lì)學(xué)術(shù)界、制藥業(yè)和合同研究組織/合同制造組織之間的協(xié)同作用。

美國化學(xué)學(xué)會 (ACS) 是世界上最大的科學(xué)學(xué)會，它是 ACS 綠色化學(xué)研究所 (GCI) 的主辦單位，其使命是在全球化工企業(yè)和整個(gè)社會中促進(jìn)和推動綠色和可持續(xù)化學(xué)與工程的實(shí)施。^[1]為滿足其加快綠色化學(xué)工業(yè)應(yīng)用的重點(diǎn)，ACS GCI 發(fā)起了一系列工業(yè)、非競爭性合作（稱為圓桌會議）。2005 年，ACS GCI 制藥圓桌會議 (GCIPR) 由三家公司組成，現(xiàn)已成為會員 到 2019 年已經(jīng)增長到 29 家。

早些年，圓桌會議專注于小分子化學(xué)，但逐漸發(fā)展到滿足行業(yè)更廣泛的需求和利益。這包括大分子，這是圓桌會議綠色生物制劑團(tuán)隊(duì)的主要關(guān)注點(diǎn)。^[2，3]此外，一個(gè)新興的重要領(lǐng)域是“中分子”的概念，通常是合成生產(chǎn)的，比標(biāo)準(zhǔn)小分子大，包括肽等形式。這些“中等分子”可以粗略地定義為分子量范圍在 1000 到 5000 Da 之間的 API。許多肽產(chǎn)品符合這一定義，并且是生物制藥行業(yè)中一個(gè)顯著增長的領(lǐng)域，市場上有 50 多種肽藥物，約 170 種處于臨床試驗(yàn)階段，超過 200 種處于臨床前開發(fā)階段。^[4]然而，目前肽合成技術(shù)的發(fā)展水平主要涉及使用大量高危試劑和溶劑的傳統(tǒng)技術(shù)，很少關(guān)注綠色化學(xué)和工程。^[5]例如，大部分副產(chǎn)廢物流是用于固相肽合成 (SPPS) 的有害溶劑 N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 和 N-甲基-2-吡咯烷酮 (NMP)。許多更綠色的溶劑應(yīng)該在這個(gè)領(lǐng)域找到實(shí)用性，但需要付出巨大的努力，因?yàn)檫@些過程中的大多數(shù)是由制造商使用幾十年前的實(shí)踐操作的，而綠色化學(xué)并不是一個(gè)重點(diǎn)領(lǐng)域。導(dǎo)致環(huán)境狀況不佳的另一個(gè)原因是色譜法的普遍和廣泛使用來生產(chǎn)具有所需質(zhì)量屬性的肽產(chǎn)品。2016 年，ACS GCI 制藥圓桌會議將開發(fā)更環(huán)保的肽工藝確定為一個(gè)關(guān)鍵的未滿足需求，并成立了一個(gè)新的圓桌會議團(tuán)隊(duì)來解決這一重要領(lǐng)域。該小組的最初重點(diǎn)是突出當(dāng)前肽合成的最佳實(shí)踐并鼓勵(lì)更多需要的創(chuàng)新。從這個(gè)角度來看，我們旨在總結(jié)當(dāng)前肽合成和純化在可持續(xù)性方面面臨的挑戰(zhàn)，并強(qiáng)調(diào)可能的解決方案。

肽的早期合成是在溶液中進(jìn)行的，需要仔細(xì)操作保護(hù)基團(tuán)和多個(gè)具有挑戰(zhàn)性的后處理和分離。^[6]使用這種方法學(xué)對于合成更長和更復(fù)雜的肽可能會有問題，但對于較短的肽和片段仍然有效。^[7]

2.1.1 耦合劑

盡管酰胺鍵的形成是制藥工業(yè)中最突出的轉(zhuǎn)化之一，但它仍然缺乏通用和穩(wěn)健的催化方法。Beller、Milstein、Goo?en 和 Sheppard 的出色報(bào)告為未來的發(fā)展鋪平了道路，^[26-30]但要達(dá)到成熟和可行的催化協(xié)議在活性藥物成分(API)中的應(yīng)用還有很長的路要走。僅從毒理學(xué)和監(jiān)管的角度來看，API中過渡金屬的殘留水平需要非常低，通常為10 ppm或以下，這進(jìn)一步增加了技術(shù)挑戰(zhàn)。

因此，目前肽合成中的大多數(shù)酰胺偶聯(lián)方案都涉及使用苯并三唑衍生物。其中的關(guān)鍵例子是脲/胺鹽 HATU、HCTU 和 TBTU；鏻鹽 PyBOP、PyAOP 和 PyClock；以及碳二亞胺與 HOBt、HOAt 或 6-Cl-HOBt 的組合。^{[31，32]}這些試劑提供高偶聯(lián)效率和低氨基酸外消旋化，并且作為固體穩(wěn)定，其中一些甚至在溶液中穩(wěn)定。然而，據(jù)報(bào)道苯并三唑基序具有爆炸性，使得放大和在高溫下工作變得困難。^[33]此外，這些試劑的原子效率非常差。

不幸的是，對于肽合成過程中酰胺鍵的綠色形成，目前還沒有通用的解決方案，特別是對于長肽。最大的挑戰(zhàn)之一是肽的復(fù)雜性在過去十年中顯著增加，許多肽產(chǎn)品現(xiàn)在含有超過 30 個(gè)氨基酸。^[34]該領(lǐng)域過于廣泛，無法在本展望中詳細(xì)介紹。不斷開發(fā)新的偶聯(lián)試劑，但其可持續(xù)性特性并未經(jīng)過全面測試。圖1描述了具有更可持續(xù)性試劑的相關(guān)例子。氰基（羥基亞氨基）乙酸乙酯“oxyma pure”，^[35]它與碳二亞胺結(jié)合使用，其衍生的脲鹽 COMU36^[36]通常表現(xiàn)出與苯并三唑?qū)?yīng)物相同或更好的偶聯(lián)效率和更低的氨基酸外消旋化。COMU 的限制之一是它在自動化應(yīng)用中的應(yīng)用，由于其在 DMF 中的不穩(wěn)定性，固相肽合成非常有限。然而，最近的一項(xiàng)研究表明，COMU 在 γ-戊內(nèi)酯中相對穩(wěn)定，這使得它對于更環(huán)保的自動化固相肽合成可能更具吸引力。^[37]最后，必須注意另一篇最近的出版物，報(bào)告了差示掃描量熱法（DSC) 研究，將 COMU 歸類為肽生產(chǎn)的“最不優(yōu)選”試劑。^[38]因此，COMU 的實(shí)用性仍然存在問題。

其他較少使用但相對綠色的偶聯(lián)劑是 TFFH 及其衍生物，可原位生成氨基酰氟并已應(yīng)用于許多固相肽合成，[39]以及在溶液中穩(wěn)定的丙基膦酸酐 (T3P) 并且可以潛在地用于SPPS。^[40]

大分子肽商業(yè)合成的現(xiàn)有技術(shù)仍主要使用 DIC/HOBt。然而，“oxyma pure”的使用在工業(yè)上獲得了顯著的吸引力。最后，對酰胺鍵的替代方法也提出了相關(guān)的觀點(diǎn)，旨在提高原子效率和與各種溶劑的相容性以及其他性能。^[41]這些方法中的大多數(shù)還沒有達(dá)到預(yù)期的綠色，或者還不能完全應(yīng)用于肽的合成，但我們相信這類研究將為更環(huán)保的解決方案鋪平道路。還需要考慮這些潛在的原材料供應(yīng)鏈新方法，例如 Fmoc-氨基酸。

2.1.2 溶劑

溶劑代表了化學(xué)過程中產(chǎn)生的絕大多數(shù)廢物，這與固相肽合成尤其相關(guān)。因此，使用更環(huán)保的溶劑或?qū)ふ覝p少或回收溶劑的方法具有很高的興趣。用于固相肽合成的主要溶劑是 DMF、NMP，以及少量的二氯甲烷、二乙醚和叔丁基甲基醚。所有這些溶劑都存在各種危害。最重要的是，DMF 和 NMP 具有生殖毒性危害，并可能受到歐洲化學(xué)品注冊、評估、授權(quán)和限制條例（范圍）的限制或授權(quán)，最終可能會排除這些溶劑的使用。^[42]

因此，對合成肽綠色溶劑包括溶劑與其他物質(zhì)的相容性需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。理想的溶劑應(yīng)該能夠溶解所有肽合成試劑，實(shí)現(xiàn)高效的酰胺鍵形成反應(yīng)和脫保護(hù)，并使所選的固體支持物溶脹。

近年來，許多更環(huán)保的溶劑已用于肽合成。例如，2-MeTHF（2-甲基四氫呋喃）已被用于在聚乙二醇載體（ChemMatrix）上固相合成 Aib-腦啡肽五肽。偶聯(lián)條件為 2-MeTHF 中的 DIC/Oxyma Pure，并在 2-MeTHF 中用 20% 哌啶去除 Fmoc 基團(tuán)。^[43]最近，γ-戊內(nèi)酯已被用作 Aib-ACP 的 SPPS 的 DMF 替代品 ChemMatrix 樹脂上的十肽。^[37]在這種情況下，DMF 仍用于洗滌和 Fmoc 去除步驟。有研究者成功在聚苯乙烯和聚乙二醇 (ChemMatrix) 樹脂上使用 20% 哌啶在 γ-戊內(nèi)酯中成功去除 Fmoc。^[44]有趣的是，該研究表明，最常見的 Fmoc-氨基酸衍生物可溶于 γ-戊內(nèi)酯 >0.1 M，這使得溶劑可用于自動合成。

碳酸丙烯酯已用于溶液中的肽合成（Boc/Bn 策略）和在 ChemMatrix 樹脂上手動固相合成九肽緩激肽（Fmoc/tBu 策略）。固相偶聯(lián)時(shí)間比平時(shí)長（2×1 h），但在這種情況下，偶聯(lián)和 Fmoc 去除均在碳酸亞丙酯中進(jìn)行。^[5]研究組發(fā)表了關(guān)于各種樹脂在綠色溶劑中溶脹的深入研究，這對于未來的綠色肽合成非常有用。^[45]

最近，對 DMF 替代 SPPS 的深入研究表明，N-丁基吡咯烷酮 (NBP) 是某些應(yīng)用的合適替代品。^[46]突出的缺點(diǎn)之一是NBP的粘度高于已建立的溶劑（如DMF），盡管提出了加熱作為在合成過程中克服該問題的解決方法。然而，盡管替代溶劑具有一定的效果，但大多數(shù)示例都是針對非常短的模型肽。對于大分子肽工業(yè)化合成也有一定的啟示。

對于有毒和有害溶劑使用的可持續(xù)性問題可通過在水中實(shí)現(xiàn) SPPS來解決。在室溫下已有一些成功的案例。^[47-50]例如，EDC-HONB 作為偶聯(lián)劑，通過兩性離子去污劑和微波輻射偶聯(lián)某些 Boc 保護(hù)的氨基酸，成功在 PEG 基樹脂上合成 Leu-腦啡肽。^[48]納米顆粒形式的 Fmoc-氨基酸也已成功用于在水中進(jìn)行SPPS。^[51]一些有助于水性 SPPS 的水溶性保護(hù)基團(tuán)和磺化版本的 Fmoc、Boc 保護(hù)基已獲得相關(guān)專利。^[49,52]此外，在有機(jī)溶劑中進(jìn)行偶聯(lián)和脫保護(hù)步驟，并洗滌非水溶劑，以提高工藝的綠色性已獲得有效解決，最大限度地減少與水合成相關(guān)的副反應(yīng)。^[53] 同時(shí)，對危險(xiǎn)的三氟乙酸可用非氟化產(chǎn)品來替代。

2.1.3 更環(huán)保的固相肽合成的樹脂

樹脂回收主要針對2-氯三苯甲基樹脂進(jìn)行了描述，但據(jù)我們所知，這仍然是一個(gè)非常小的研究領(lǐng)域。^[54-56]許多新型綠色樹脂（即基于聚乙二醇的樹脂）的一個(gè)重要特征是它們在大多數(shù)溶劑中，尤其是在三氟乙酸中的溶脹程度明顯更高。這使得單位質(zhì)量樹脂所需的溶劑大得多。與聚乙二醇基樹脂相比，聚-ε-賴氨酸樹脂 SpheriTide 與綠色溶劑的相容性較差。但是，它具有高負(fù)載和可生物降解性，并且樹脂的起始材料來自可再生資源。^[45]我們相信理想的樹脂應(yīng)該溶脹到足以使反應(yīng)有效發(fā)生，但溶脹不會超過要求，理想情況下應(yīng)該與更環(huán)保的溶劑相容。

2.1.4 化學(xué)連接

自第一個(gè)天然化學(xué)連接 (NCL) 開發(fā)以來，未受保護(hù)的肽片段，不可能或非常難以合成的長肽和蛋白質(zhì)獲得了合成方法。^[57,58]這種合成方法可能會提供更高的產(chǎn)量， 更純凈的原油，減少溶劑的使用。此外，大多數(shù)連接反應(yīng)是可在水性條件下進(jìn)行。

天然化學(xué)連接的最新應(yīng)用包括合成酶 Sortase A 和同位素標(biāo)記的人胰島素。^[59-61]SPPS 主要用于連接 C 端含硫酯肽和 N 端含Cys 肽片段。^[62]作為 NCL 的延伸，蛋白連接 (EPL) 涉及重組表達(dá)以合成肽或蛋白質(zhì)片段。因此，帶有C末端硫酯的蛋白質(zhì)可以與具有 N 末端 Cys 的合成肽片段連接，可用于合成非天然蛋白質(zhì)。^[63,64]總體而言，自 1990 年代初期以來，學(xué)術(shù)界在綠色連接方法方面的進(jìn)展一直很突出。然而，工業(yè)上的牽引力很小。可能鼓勵(lì)工業(yè)采用的關(guān)鍵改進(jìn)是改進(jìn)樹脂的開發(fā)和硫酯的合成。此外，開發(fā)在連接過程中將半胱氨酸脫硫?yàn)楸彼岬木G色方法可以顯著改善范圍。 

最后，最近的評論中介紹了幾種有前途的無半胱氨酸肽化學(xué)連接形式（圖2）。^[62，65]

? Staudinger ：帶有膦的肽硫酯通過與 N 端疊氮化物反應(yīng)形成酰胺鍵。^[66，67]這種連接最近已應(yīng)用于聚糖-肽綴合物的合成。^[68]

? Ser/Thr ：帶有 C 端 o-水楊醛酯的肽通過惡唑烷中間體與含有 N 端 Ser 或 Thr 的肽形成酰胺鍵。^[69，70]最近的例子是合成teixobactin 和類似物。^{[71，72]}需要解決的一點(diǎn)是，標(biāo)準(zhǔn)的連接方案要求使用吡啶/醋酸（6：1）。

? KAHA：在C末端帶有α-酮酸的肽與在N末端帶有羥胺的另一個(gè)肽形成天然酰胺鍵。^[73]最近的一個(gè)例子是合成高度疏水的抗病毒膜相關(guān)蛋白 IFITM3^[74]。

2.1.5 小規(guī)模快速合成的進(jìn)展

通過將試劑和溶劑限制在特定區(qū)域來合成肽，^[75]在紙上的溶劑排斥聚四氟乙烯屏障，將各種試劑定位并洗滌在紙的未涂覆部分，使平行流動合成，這也易于紅外輻射(IR)加熱，以提高耦合效率。^[76]這是用于篩選目的的可持續(xù)合成肽庫的創(chuàng)新示例。氟混合物合成 (FMS) 已成功應(yīng)用于合成三肽和五肽文庫，使用分體式液相組合合成，以氟-Fmoc (f-Fmoc) 試劑作為編碼標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)快速分離。^{[77，78]}這是不同多肽合成的一個(gè)很好的例子 ，除了線性肽生成方面的進(jìn)展，環(huán)肽文庫也通過 NCL 方法獲得。^[79]最后，利用Cys殘基和全氟芳基連接物進(jìn)行聚合的基于snar的多樣性導(dǎo)向側(cè)鏈大環(huán)化反應(yīng)，可以快速合成大環(huán)肽庫。^[80]

2.1.6 肽生產(chǎn)

2.1.6.1 概述

隨著制藥行業(yè)對肽的興趣日益濃厚，公斤級合成變得相對普遍。^[81]在生產(chǎn)規(guī)模上，除了偶聯(lián)效率外，試劑的選擇還取決于安全性和價(jià)格。試劑的等量經(jīng)過仔細(xì)優(yōu)化，以最大限度地減少與 SPPS 中常規(guī)使用過量投入相關(guān)的成本。為了減少多公斤級多肽生產(chǎn)過程中的危險(xiǎn)足跡并降低成本，研究通常致力于用更簡單、更安全的試劑代替碳二亞胺等有毒試劑。一個(gè)很好的例子是使用酰氯和咪唑進(jìn)行酰胺化以生產(chǎn) HIV 蛋白酶抑制劑候選物。^[82]通常，會降低試劑當(dāng)量并消除雙重耦合，同時(shí)延長耦合時(shí)間以實(shí)現(xiàn)相同的效率并減少廢物產(chǎn)生。在較小的學(xué)術(shù)規(guī)模和早期藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，通常使用 2 到 10 當(dāng)量的試劑來確保接近完全的偶聯(lián)，而肽的制造過程通常要求使用不超過 30-50% 的過量試劑 每個(gè)耦合。通常對于較小的肽（<10 個(gè)氨基酸），可用液相化學(xué)進(jìn)行優(yōu)化，盡量減少試劑浪費(fèi)。然而，即使對于中等長度的肽，中間體的分離和純化也可能具有挑戰(zhàn)性。已有關(guān)于連續(xù)溶液相肽合成的報(bào)道。通過利用試劑的緩沖水萃取和水溶性 Fmoc 去封閉加合物，避免了傳統(tǒng)溶液化學(xué)的純化挑戰(zhàn)。^[83]為了實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)量，混合 SPPS/LPPS 經(jīng)常用于生產(chǎn)。例如，HIV 膜融合抑制劑 Enfuvirtide/T20 是一種 36 個(gè)氨基酸的肽，通過混合溶液和固相化學(xué)以每年數(shù)噸的規(guī)模進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)。^[84]其他例子包括艾塞那肽和利拉魯肽的混合 SPPS/LPPS 工藝。^[85-87]通常，開發(fā)了多種途徑和工藝來應(yīng)對大規(guī)模肽合成的挑戰(zhàn)。一個(gè)典型的例子是奧曲肽的合成，一種SRIF 激動劑的環(huán)狀八肽。^[88]

2.1.6.2 肽合成的指標(biāo)

據(jù)報(bào)道，肽生產(chǎn)中的廢物熱電聯(lián)產(chǎn)為每公斤肽^[89,90]數(shù)量級，而小分子合成的廢物為數(shù)百公斤數(shù)量級。^[91]

一句行之有效的管理格言是“你無法管理你不衡量的東西”。然而，盡管在肽制造中明確需要度量標(biāo)準(zhǔn)，但一直沒有顯著的應(yīng)用。工藝質(zhì)量強(qiáng)度 (PMI)^[92]和完全 E 因子 (cEF)^[93,94]已成為小分子藥物合成中副產(chǎn)工藝廢物的主要衡量標(biāo)準(zhǔn)，最近被整合為創(chuàng)新綠色愿望水平 (iGAL) 的基本要素。iGAL 代表了第一個(gè)使用 100 美元/mol 起始材料規(guī)則的標(biāo)準(zhǔn)化工藝廢物分析，它通過藥物復(fù)雜性和開發(fā)階段調(diào)整后的工藝與行業(yè)平均水平的比較來量化相對工藝綠色度 (RPG = iGAL/cEF)，因此， 它可以通過綠色化學(xué)創(chuàng)新記分卡輸出公平的綠色工藝評級，該記分卡可在 ACS 網(wǎng)站上免費(fèi)訪問。^[95]此外，記分卡通過 RPG 升級的程度和當(dāng)前制造過程與早期版本相比的浪費(fèi)減少量，來量化過程科學(xué)家的創(chuàng)新影響。作為起點(diǎn)，鼓勵(lì)合同制造組織 (CMO) 和制藥公司開始為其制造過程收集 PMI/cEF 數(shù)據(jù)。

為了了解肽與小分子合成中的共生廢物量并有意義地評估其 RPG，因此應(yīng)該應(yīng)用 iGAL 方法。然而，分析的障礙是 iGAL 的 100 美元/mol 起始材料規(guī)則，因?yàn)橘徺I的肽構(gòu)建塊通常 超過這個(gè)“商品類型”的限制，需要付出巨大的努力來確定與這些構(gòu)件的生產(chǎn)相關(guān)的廢物。幸運(yùn)的是，肽與小分子不同，我們正在處理數(shù)量有限的常見構(gòu)建塊。因此，一個(gè)可行的解決方案是創(chuàng)建一個(gè) iGAL 清單，其中包含常見肽構(gòu)建塊的內(nèi)在 cEF，以標(biāo)準(zhǔn)化和促進(jìn)分析。ACS GCI PR 正在努力在其網(wǎng)站上提供常見的氨基酸 iGAL 清單。肽藥物的 iGAL 分析結(jié)果將在適當(dāng)時(shí)候報(bào)告。圓桌會議的未來工作還將針對收集肽藥物制造過程的指標(biāo)數(shù)據(jù)并報(bào)告數(shù)據(jù)。

由于合成過程中的失敗模式，線性SPPS的效率普遍下降，特別是對于序列>15個(gè)氨基酸殘基。^[84]這對產(chǎn)品純化復(fù)雜性和整體工藝收率有相應(yīng)的影響。此外，疏水性氨基酸序列問題可能會限制總產(chǎn)量。這通?？梢詺w因于樹脂上的聚集現(xiàn)象。在大多數(shù)情況下，這些問題可以通過結(jié)合肽專業(yè)知識、經(jīng)驗(yàn)和幾十年的SPPS調(diào)查收集的知識來克服。然而，冗長的線性綜合具有很高的內(nèi)在風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)橐粋€(gè)錯(cuò)誤可能會導(dǎo)致全部損失。在合同制造組織中，大分子肽（>30-mer）化學(xué)合成的失敗率估計(jì)約為20%。上述化學(xué)連接方法和混合 SPPS/LPPS 策略可以解決其中一些問題，但顯然仍然需要替代方法和技術(shù)，以最終提高整體效率并減少肽合成和生產(chǎn)對環(huán)境的影響。^{[7，96，97]}

2.2.1 流動中的肽合成

流動化學(xué)具有綠色證書，因?yàn)榭焖賯鳠峥蓽p少能源使用和反應(yīng)時(shí)間，從而減少整體環(huán)境影響。由于用于小規(guī)模肽和蛋白質(zhì)合成的填充床流 SPPS 的迅速發(fā)展和實(shí)施，最近在肽合成^[98，99]中的 SPPS 流研究的復(fù)興已經(jīng)很明顯了。^[100]這些成就，包括復(fù)雜蛋白的超快速合成^[101]和全系統(tǒng)自動化^[102]，重新振興了一個(gè)研究領(lǐng)域。在 Merrifield 的 SPPS 概念扎根于研究實(shí)驗(yàn)室^{[103，104]}并專注于在線反饋、減少材料使用、和自動化。[105]到目前為止，很少有關(guān)于流動中可擴(kuò)展 SPPS 的報(bào)告，^{[106，107]}盡管正在嘗試使用連續(xù)帶方法來糾正這一問題，通過連續(xù)專門設(shè)計(jì)的反應(yīng)器單元進(jìn)料。^[108]

使用 LPPS，以便快速、高效和低浪費(fèi)的方式快速合成小肽片段。^[109,110]對于使用低成本、通過 N 羧酸酐提高原子效率的氨基酸活化 (NCAs) 進(jìn)行了調(diào)查， 結(jié)果證明使用連續(xù)攪拌釜反應(yīng)器 (CSTR) 裝置和水性反應(yīng)介質(zhì)合成二肽和三肽的高通量、生產(chǎn)率和PMI 顯著降低 (>100 倍)。^[111]

將流動化學(xué)用于混合 SPPS/LPPS 肽工藝是一項(xiàng)具有吸引力的選擇。在樹脂上生產(chǎn)小片段（<10-mers）可能是理想的工藝中間體或監(jiān)管起始材料，這些材料純度高，穩(wěn)定，并且不需要專門的運(yùn)輸或儲存條件。這些片段將從樹脂上切割下來并通過 LPPS 與其他片段偶聯(lián)。Enfuvirtide/T20 生產(chǎn)是利用這種通用策略的批處理過程的一個(gè)典型例子。^[84]

2.2.2 綠色標(biāo)簽輔助 LPPS（標(biāo)簽 LPPS）

在 Merrifield 對肽合成領(lǐng)域做出開創(chuàng)性的 SPPS 貢獻(xiàn)后不久，新發(fā)明方法的局限性（主要是副反應(yīng)和大量試劑過量以克服固相基質(zhì)擴(kuò)散并實(shí)現(xiàn)所需的高耦合轉(zhuǎn)化率）推動了對改進(jìn) LPPS 方法研究。使用可溶性“標(biāo)簽”，例如聚苯乙烯（PS，無交聯(lián)）^[112]和聚乙二醇 (PEG)，^[113,114]為生長受保護(hù)的肽鏈提供增溶錨，從而產(chǎn)生均勻的溶液動力學(xué)，從而可能減少對大量過量試劑的需求 SPPS。在可溶性 PS 的情況下通過沉淀或結(jié)晶實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)循環(huán)之間的副產(chǎn)物和試劑的去除（通過在 SPPS 中的樹脂洗滌實(shí)現(xiàn)）。盡管溶劑膜存在不相容性問題，且UF 循環(huán)時(shí)間太長，但超濾 (UF) 使用膜技術(shù)也還是獲得了成功。^[113-115]

標(biāo)簽輔助 LPPS 概念在過去十年中得到了進(jìn)一步發(fā)展。^[116-119]這些小組從上述早期工作和先前在組合化學(xué)中使用定義結(jié)構(gòu)的親脂性“標(biāo)簽”獲得了靈感。^[120]圍繞這種肽合成方法的廣泛應(yīng)用仍然存在問題，特別是所選“標(biāo)簽”是否可以為肽延伸提供所需的普遍溶解度。Chiba 等人的研究指出，在實(shí)踐中，需要物理壓力（使用連接的玻璃注射器）來調(diào)動不斷增長的彈性蛋白肽鏈，使其足以進(jìn)行合成。^[121]Kent 等人發(fā)表了一篇文章作為回應(yīng)，他們認(rèn)為交聯(lián)固體支持物提供的通用增溶能力意味著 SPPS 仍將是肽合成的主要方法。^[122]然而，也有報(bào)道稱， 與等效的 SPPS 方法相比，“標(biāo)記 LPPS”方法可以將 20 聚體肽的溶劑浪費(fèi)減少 12 倍以上。^[123]這是通過增加錨定分子的親脂性來實(shí)現(xiàn)的，錨定分子具有長烷基鏈作為 C 末端保護(hù)基團(tuán)，從而合成肽，其中中間體通過溶劑萃取而不是沉淀分離。^[123]同時(shí)，對Fmoc 去除條件進(jìn)行了優(yōu)化，以促進(jìn)通過堿性水洗去除二苯并富烯加合物。通過在硫代蘋果酸存在下使用 DBU 去除 Fmoc 以形成水溶性二苯并富烯加合物。^[123]

最后，描述了一種相關(guān)的方法——基團(tuán)輔助純化 (GAP)，它使用三苯基氧化膦“標(biāo)簽”來沉淀生長的肽鏈，包括回收“標(biāo)簽”的潛力，從而可能減少合成過程中的總體浪費(fèi)。^[124]

2.2.3 有機(jī)納濾/基于膜的反應(yīng)器系統(tǒng)

在1970年代，膜的有機(jī)溶劑相容性首次被研究，其發(fā)展^[125]重新點(diǎn)燃了對去除肽合成副產(chǎn)物和試劑的研究，^[126，113]PEG標(biāo)簽再次用于標(biāo)簽輔助LPPS，在耦合和纖維膜循環(huán)之間的定體積透濾系統(tǒng)中使用了幾種不同的膜類型。這在兩個(gè)小肽（4 聚體和 5 聚體）上得到了證明。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了減少肽制造過程中產(chǎn)生的高溶劑廢物負(fù)擔(dān)的潛力。在高稀釋肽環(huán)化反應(yīng)的背景下，進(jìn)一步研究和證明了這種溶劑浪費(fèi)的減少。^[127]

最近，該領(lǐng)域發(fā)表的工作側(cè)重于對 MEPS 工藝參數(shù)的理解，以控制和減少合成中的故障模式。^[128]此外，MEPS 中使用的“標(biāo)簽”的進(jìn)一步開發(fā)已經(jīng)發(fā)表，超越了線性聚合物（如 PEG、PS ) 到支鏈錨，目的是降低生長肽鏈的滲透性，從而減少通過膜的產(chǎn)量損失。^[129]

2.2.4 酶肽連接

化學(xué)酶促合成多年來一直是一個(gè)研究領(lǐng)域，有望實(shí)現(xiàn)高特異性、^[130]溫和的反應(yīng)條件和減少的廢物流。各種連接酶（如分選酶、丁酸酶、肽連接酶或全連接酶）能夠?qū)崿F(xiàn)化學(xué)選擇性肽連接。最近，EnzyPep B.V. 對其進(jìn)行了改進(jìn)和證明，以催化有效的肽環(huán)化和無保護(hù)肽片段的無痕縮合，用于中到大型肽靶標(biāo)的合成。^{[131，132]}這種片段縮合方法的實(shí)際好處主要是水性偶聯(lián)條件下使用未受保護(hù)的肽片段，避免了阻礙更傳統(tǒng)化學(xué)片段縮合方法的溶解度問題。胸腺素α 和艾塞那肽的合成被證明可行。^[133]

2.2.5 機(jī)械化學(xué)

機(jī)械化學(xué)通過誘導(dǎo)的機(jī)械能（例如，通過在球磨機(jī)中研磨所有反應(yīng)物）促進(jìn)固體之間的反應(yīng)，并且該領(lǐng)域自 1990 年以來一直在迅速擴(kuò)大。^[134-137]評估了無溶劑合成或最小溶劑合成（液體輔助研磨） 通過與 α-氨基酸、酰胺、 或球磨機(jī)中的酯類。^[138-141]此外，該反應(yīng)顯示了使用機(jī)械化學(xué)和流動化學(xué)原理的短肽（2-3 個(gè)氨基酸）應(yīng)用的機(jī)械化學(xué)演變。^[142]研究表明，機(jī)械化學(xué)是一種環(huán)境友好的替代方法，可用于制備高濃度的短肽，差向異構(gòu)化率低。

肽的純化和/或分離通常是制造過程的瓶頸。此外，還會產(chǎn)生大量高放水/低有機(jī)廢物。 

HPLC 是肽純化和反離子交換最常用的技術(shù)。^[143]反相 (RP) 和離子交換 (IEX) 色譜法是純化肽的首選，可提供高分辨率、穩(wěn)健性和輸出重現(xiàn)性。然而，肽與柱填料的相互作用與有機(jī)小分子的相互作用顯著不同。目前市場上有用于肽純化的混合模式色譜 (MMC) 柱，其中溶質(zhì)在分離過程中與固定相有不止一種相互作用。這些相互作用不僅是疏水的或離子的，而且是疏水/離子、疏水/親水、親水/離子（I-IV 型混合珠）。^[144]混合模式色譜可用作 RP、IEX 或正相色譜純化肽的替代或補(bǔ)充技術(shù)。^[145]

與 MMC 類似的技術(shù)是摻雜反相色譜法 (DRP)。DRP色譜使用不同的配體（一種離子交換配體類型和一種反相配體類型），與MMC相比具有更多優(yōu)勢，因?yàn)榭梢酝ㄟ^改變其中一種的摻雜濃度來改變?nèi)苜|(zhì)和固定相之間的相互作用機(jī)制。其次，它可以用于吸引-排斥模式，其中離子交換基團(tuán)對分析物處于排斥模式。^[146]最后，使用多柱逆流溶劑梯度純化（MCSGP）色譜法證明了肽的純化。重疊餾分的內(nèi)部循環(huán)和再分離提高了產(chǎn)量和生產(chǎn)率，同時(shí)減少了溶劑消耗。^[147]

與標(biāo)準(zhǔn) RP-HPLC 相比，MMC 和 MCSGP 技術(shù)表現(xiàn)出更快的分離速度、更高的產(chǎn)量和更高效的工藝。此外，它們還減少了有害廢物的產(chǎn)生、水的消耗，并減少了凈化過程的循環(huán)時(shí)間。

與傳統(tǒng) HPLC 相比，SFC 具有多項(xiàng)優(yōu)勢，例如速度快、可實(shí)際使用更長的色譜柱、正相保留機(jī)制以及減少有機(jī)溶劑的使用。SFC 可用于純化多達(dá) 40 聚體的肽，包括線性和環(huán)狀。它使用 CO2 作為帶有改性劑（例如甲醇、乙醇、2-丙醇）和添加劑（例如 TFA 或乙酸銨）的流動相。^[148，149]Zheng等人認(rèn)為，流動相修飾劑的酸度是關(guān)鍵的，TFA添加劑的含量隨多肽的不同而變化。與HPLC相比，SFC在綠色色譜方面似乎是一種很有前途的技術(shù)，因?yàn)樵赟FC純化過程中使用的二氧化碳具有回收利用的可能性（到目前為止，仍是一個(gè)未解決的話題）。與目前的凈化方法相比，SFC產(chǎn)生不到三分之一的有機(jī)廢物，具有環(huán)保性質(zhì)。^[150]同樣的工作還報(bào)告說分析時(shí)間減少了 5 倍。SFC 的其他優(yōu)點(diǎn)包括：使用較少毒性的改性劑，實(shí)現(xiàn)更好的手性化合物分離度和 CO2 的特殊屬性，例如不易燃、無毒，并且成本低于大多數(shù)有機(jī)溶劑。這種技術(shù)的缺點(diǎn)包括較高流速產(chǎn)生的熱量可能會降低分辨率，并且沒有多少涉及肽的研究可用。

LLE，也稱為溶劑萃取，是在液相肽合成中分離中間體的最古老和最廣泛使用的方法。^[151]多年來，為了最大限度地提高萃取效率和減少溶劑，已經(jīng)開發(fā)了一系列 LLE 改進(jìn) 消費(fèi)和生產(chǎn)成本。相關(guān)的例子是連續(xù)流動系統(tǒng)中的液-液萃取，^[152,153]水力旋流器中的微滴旋轉(zhuǎn)，^[154]攪拌/攪拌萃取柱^[155]和混合沉降器。^[156]這些可替代的LLE程序尚未廣泛應(yīng)用于多肽的合成，或研究結(jié)果尚未發(fā)表。

另一方面，ELLE（對應(yīng)選擇性液-液萃?。┩ǔＳ糜诜蛛x包括氨基酸在內(nèi)的對映異構(gòu)體。^[157]此外，離子液體-有機(jī)溶劑萃取被應(yīng)用于二肽和三肽的純化，實(shí)現(xiàn)了良好的分離，并利用離子液體的循環(huán)特性。^[158]

3.4.1 通過沉淀過程消除離子交換色譜法

由于肽的裂解和反相純化技術(shù)的性質(zhì)，由SPPS生產(chǎn)的肽通常作為其TFA鹽制備。^[159]離子交換色譜法是將肽 TFA 鹽轉(zhuǎn)化為藥學(xué)上可接受的鹽的標(biāo)準(zhǔn)方法。^[160]就安進(jìn)公司的 etelcalcetide（圖3）而言，將肽 TFA 鹽轉(zhuǎn)化為最終的 HCl 鹽涉及使用醋酸樹脂進(jìn)行離子交換層析以形成醋酸鹽，然后在稀 HCl 中進(jìn)行幾次凍干循環(huán)以去除醋酸 并用氯化物交換醋酸鹽。這種兩步轉(zhuǎn)化過程雖然有效，但能量和體積密集，離子交換本質(zhì)上是稀釋的，并且通常需要多次凍干以去除乙酸。整個(gè)兩步過程在商業(yè)規(guī)模上可能需要數(shù)周時(shí)間，必要的水量和巨大的凍干能力需求是大規(guī)模肽生產(chǎn)的主要瓶頸，對滿足商業(yè)藥物需求構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)。

Amgen 和 Bachem 合作開發(fā)了一種值得注意的解決方案，解決兩步的大體積離子交換/凍干序列。^[161]對起始材料和產(chǎn)品的表征揭示了兩者之間的顯著溶解度差異 etelcalcetide-TFA鹽和所需的鹽酸鹽；TFA 鹽在2-丙醇中的溶解度為100 mg/mL，而鹽酸鹽在同一溶劑中的溶解度為<1mg/mL。通過利用小分子溶解度和結(jié)晶工程原理，該團(tuán)隊(duì)能夠設(shè)計(jì)所需的 HCl 鹽在 2-丙醇水溶液中的受控沉淀。將 etelcalcetide-TFA 鹽作為 2-丙醇水溶液中的溶液加入溶液中HCl 在 2-丙醇中的濃度；然后通過過濾分離 etelcalcetide-HCl。最終結(jié)果是一個(gè)將 TFA 鹽直接轉(zhuǎn)化為 HCl 最終形式的實(shí)用過程。新的、更環(huán)保的分離工藝完全消除了離子交換色譜和每批原料藥 12 個(gè)凍干循環(huán)。通過消除對離子交換的需要，該過程的水負(fù)擔(dān)顯著降低；用于臨床生產(chǎn)的原始離子交換工藝每克原料藥需要超過 3 L 的水。該工藝在商業(yè)規(guī)模上能夠在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)器和過濾干燥器中進(jìn)行。直接鹽轉(zhuǎn)化工藝使 etelcalcetide 的生產(chǎn)能力提高了 10 倍。

3.4.2 環(huán)肽的無色譜純化

大環(huán)肽在治療領(lǐng)域非常重要，因?yàn)樗鼈兊拇笮『腿壗Y(jié)構(gòu)使其成為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的理想選擇。^[162]這個(gè)簡短的案例研究將強(qiáng)調(diào)通過化學(xué)創(chuàng)新提高純大環(huán)肽分離的重要進(jìn)展。^[163]通過取代溶劑密集型色譜，該技術(shù)極大地提高了獲取大環(huán)肽的綠色性。這是值得注意的，因?yàn)榕c色譜相關(guān)的溶劑使用占 PMI 的很大一部分。在這項(xiàng)由 BMS 創(chuàng)新資助資助的 Bristol-Myers Squibb 研究中，全長合成肽在 N 末端用正交雙模式接頭進(jìn)行修飾，該接頭能夠首先實(shí)現(xiàn)線性肽的固相“捕獲”，然后是堿基 介導(dǎo)的環(huán)化和同時(shí)“釋放”所需的純肽大環(huán)化合物。應(yīng)變輔助疊氮化物-炔烴環(huán)加成 (SPAAC) 被證明是一種通用的正交捕獲技術(shù)，可廣泛應(yīng)用于各種大小的各種目標(biāo)肽（5-20 元件演示）（圖4）。

近年來，減少尖端藥物化學(xué)合成生產(chǎn)中的復(fù)雜性，對環(huán)境影響的創(chuàng)新方法，兩者相匹配的研究已成為研究熱點(diǎn)。限制化學(xué)品對人類和環(huán)境的負(fù)面影響是全球努力的重要部分，對于研究和生產(chǎn)中常用的試劑、溶劑和樹脂的綠色安全性有了更高的標(biāo)準(zhǔn)。目前學(xué)術(shù)界和工業(yè)界在更環(huán)保的肽合成和純化領(lǐng)域都取得了相關(guān)進(jìn)展。然而，綠色肽化學(xué)仍然是一個(gè)相對較小的研究領(lǐng)域，其中許多進(jìn)展需要很長時(shí)間才能應(yīng)用于肽的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。因此，不僅要在綠色肽化學(xué)領(lǐng)域投入更多資源，而且需要在學(xué)術(shù)界、工業(yè)界、制藥業(yè)和 CRO/CMO 之間建立更多的協(xié)同效應(yīng)。最后，重要的是決策者要調(diào)和這樣的想法，環(huán)保的方法不僅對環(huán)境更好，而且在時(shí)間和成本方面也會更加有效。

不可否認(rèn)，可持續(xù)與綠色化學(xué)合成多肽將成為未來發(fā)展的趨勢，與此同時(shí)，多肽制備工藝將得到進(jìn)一步發(fā)展和提高。作為多肽行業(yè)的從業(yè)者，湃肽已經(jīng)采取了一些通過實(shí)施綠色化學(xué)來減少對環(huán)境影響的步驟，助推多肽行業(yè)健康發(fā)展。未來，我們也將不斷的關(guān)注、研究、嘗試新的技術(shù)發(fā)展方向，并從中選擇適合自己的道路。